Новый инструмент для экспериментальной фармакологии
Немногие задумываются над тем, как лекарственные средства влияют на метаболизм друг друга при их совместном применении. Продолжительность нахождения препарата в организме (а значит, время оказания основного или побочного действия) зависит от работы ключевых ферментов — цитохромов Р450. Команда ученых РНИМУ им. Н.И. Пирогова изучает их активность для решения ряда фармакологических задач.
Подробностями исследования «Электрохимический анализ продуктов цитохром P450-зависимого метаболизма лекарственных препаратов» поделился Алексей Владимирович Кузиков, заведующий Научно-исследовательской лабораторией биокаталитических систем, кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии медико-биологического факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.
Фармакологическая мишень
Цитохромы P450 катализируют метаболизм лекарств и ряда эндогенных соединений, таких как стероидные гормоны. Эти ферменты имеют колоссальное медицинское значение. От их работы зависит:
— как долго лекарство будет находиться в организме и оказывать основное или побочное действие;
— как один препарат будет влиять на метаболизм других при комплексном приеме;
— снизится или усилится терапевтическое действие лекарственного средства при метаболизме.
Классический способ исследования
Чтобы спрогнозировать ответы на поставленные выше вопросы, часто прибегают к моделированию метаболизма лекарства при участии цитохромов P450 in vitro. Активность ферментов определяют путем анализа продуктов реакций.
Но на практике быстро и легко решить эту задачу не всегда возможно стандартными аналитическими методами. Поскольку лекарственные соединения различаются по химической природе, в каждом случае требуется подбирать оптимальные условия для анализа конкретного лекарства и его метаболита.
Кроме того, чтобы цитохром P450 осуществлял свою функцию в пробирке, ему необходимы дополнительные белки, участвующие в переносе электронов от коферментов. Можно представить, какой объем работы следует выполнить и каких финансовых затрат требует определение активности этих цитохромов при исследовании десятков или сотен лекарственных соединений.
Альтернативный метод
Очень многие проблемы позволяют решить электрохимические подходы для определения активности цитохромов P450. И мы работаем над созданием таких систем, имея за плечами большой опыт и постоянно улучшая возможности разработок для решения задач фармакологии.
В рамках проекта мы предположили, что электрохимические подходы для оценки активности цитохромов P450 можно усовершенствовать, если количественно определять образующиеся продукты ферментативных реакций путем их электрохимического окисления. Это позволит избежать дополнительных стадий анализа, отнимающих много времени, с помощью стандартных для данных целей методов.
Полагаем, что перспективой развития таких систем может быть их использование в экспериментальной фармакологии при решении ряда задач, связанных с определением фармакокинетики лекарства и оценкой вероятности возникновения побочных действий, касающихся ингибирования активности цитохромов P450.
Отличия от стандартных приемов
Исследования в этом направлении проводились, и есть достигнутые результаты. Например, разработаны коммерчески доступные тест-системы для определения активности фармакологически значимых изоформ цитохрома P450, основанные на анализе флуоресцентных метаболитов синтетических флуорогенных субстратов. Они применяются в фармакологическом анализе, если требуется оценить влияние исследуемого соединения на активность той или иной изоформы данного суперсемейства ферментов.
Однако такие системы требуют использования не только индивидуальных изоформ цитохрома P450, но и дополнительных белков, необходимых для его работы. Это значительно повышает стоимость данных исследований по сравнению с нашим подходом. Кроме того, в рамках проекта мы используем регистрацию продуктов электрохимическими, а не флуориметрическими методами, что в ряде случаев позволяет повысить чувствительность.
Принципиальное отличие нашей системы состоит в том, что для ее работы необходима только индивидуальная изоформа цитохрома P450, которая иммобилизуется на миниатюрном одноразовом электроде диаметром 2–4 мм. Он служит источником электронов для восстановления иона железа гема фермента, в результате чего последний активируется и способен метаболизировать лекарственное соединение.
Образующиеся продукты ферментативной реакции определяются на втором электроде такого же размера благодаря их электрохимическому окислению. Регистрируемый ток отражает концентрацию возникающего продукта. Предложенный нами подход для определения активности фармакологически значимых цитохромов P450 является полностью оригинальным и относительно простым в практическом применении.
Ключевые преимущества
Наша работа заключается в анализе электрохимических свойств лекарственных соединений и их метаболитов, образующихся в результате действия цитохромов P450.
Если их электрохимические свойства различаются, мы можем одновременно регистрировать наличие и количество как самого лекарственного средства, так и его метаболита в образце. Зная количество образующегося метаболита, можно рассчитать ферментативную активность цитохромов P450 и, например, сравнить ее с той, которая наблюдается в присутствии другого исследуемого соединения. Таким образом изучается влияние различных лекарственных средств на метаболизм друг друга и прогнозируется необходимость изменения дозировки при их совместном приеме.
Кроме того, мы используем электрохимические системы и для активации функциональной активности ферментов суперсемейства цитохрома P450. Для этого мы подаем электроны с электрода на ион железа гема фермента, что помогает ему активировать кислород и преобразовывать субстрат (например, лекарственное соединение). Такой подход позволяет избежать использования дополнительных белков и переносчиков электронов.
Ожидаемый результат
По итогу исследования мы бы хотели получить удобную в практическом использовании и универсальную аналитическую систему для решения задач фармакологии, связанных с определением активности цитохромов P450.
Мы уже изучили электрохимические свойства ряда нестероидных противовоспалительных средств, противоэпилептических, противоопухолевых и антикоагулянтных препаратов и их метаболитов. Полученные результаты позволили разработать электрохимические системы для определения трех фармакологически значимых изоферментов цитохрома P450.
Разработки могут использоваться в биомедицинских исследованиях при решении ряда задач, связанных с определением фармакокинетики лекарственного соединения, и оценкой вероятности возникновения побочных действий, связанных с ингибированием активности данных цитохромов.