Эфирные масла: новая методика оперативной и надежной оценки биологической активности

Эфирные масла являются одним из наиболее распространенных источников биологически активных веществ природного происхождения, способствующих нормальному развитию человеческого организма либо угнетению вредной для человека микрофлоры. Эфирные масла — это высококонцентрированные летучие жидкости, извлекаемые из различных частей растений, таких как цветок, лист, кора, стебель и корень, которые сохраняют естественный аромат, вкус и терапевтические свойства растения. При этом большинство эфирных масел содержат биологически активные вещества в значительно больших количествах, нежели иные виды растительных экстрактов; они обладают ярко выраженными пребиотическими, антимикробными, консервирующими, антиоксидантными, ароматизирующими, вкусовыми и другими свойствами, используются в фармакологии, пищевом и косметическом производствах и объем их применения постоянно растет.

Большое значение имеет оценка биологической активности эфирных масел. Анализ помогает производителям продукции определить, какие масла обладают необходимыми выраженными свойствами, эффективную концентрацию и отсеять некачественные образцы. Такая оценка чаще всего осуществляется с применением многоклеточных либо одноклеточных тестовых живых организмов.

Санкт–Петербургский государственный химико-фармацевтический университет и Институт аналитического приборостроения РАН разработали инструментальную, оперативную, доступную для широкого применения методику мультисенсорного потенциометрического микробиологического тестирования эфирных масел для определения их биологической активности в зависимости от концентрации этих масел и времени их воздействия. Методика была проверена путем визуального подсчета колоний L.acidophilus, выросших после 24 ч инкубации в отсутствие и в присутствии поочередно каждого из тестируемых масел. Объектами исследования стали 9 видов эфирных масел, промышленно получаемые из разных растений и часто используемые в фармакологии, косметическом и пищевом производствах.

Объектами исследования стали:

• корни бадана толстолистного (камнеломка, Bergénia crassifólia);
• листья и стебли полыни таврической (Artemisia taurica);
• корни чистотела большого (Chelidonium majus);
• листья эвкалипта шаровидного (Eucalyptus globulus Labill.);
• трава фиалки трехцветной (Víola trícolor);
• семена льна обыкновенного (Línum usita­tíssimum);
• трава череды трехраздельной (Bídens tripar­títa);
• плоды расторопши пятнистой (Sílybum mariánum);
• корни лопуха большого (Arctium láppa).

Метод состоит из двух этапов: первый — электрохимический, второй — математическая обработка полученных данных.

На первом этапе каждый вид эфирных масел проходит по три замера каждые 40 минут: регистрация изменений рН, а также разностей потенциалов между хлорсеребряным референсным электродом и специально разработанными индикаторными железным E_Fe и латунным E_CuZn [электродами первого рода, позволяющими оценить изменения (степени активирования либо ингибирования жизнедеятельности тестовых микроорганизмов заданными концентрациями эфирных масел) в жидкой питательной среде, инкубируемой в присутствии и в отсутствие тестируемых образцов и жизнеспособных тестовых микроорганизмов. Замеры производятся в тестовой среде, засеянной Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 (являющимися типичными представителями микробиоты человека). Параметры рH, Е_CuZn и Е_Fe были выбраны нами для оценки:

1. значения этих параметров малокритичны к прозрачности и ионной силе тестовой среды,
2. они легко и быстро могут быть измерены с помощью всего лишь одного прибора,
3. значения величин Е_CuZn и Е_Fe характеризуют не только редокс-потенциал тестовой среды , но и наличие в ней разных видов ионов, не участвующих непосредственно в окислительно–восстановительных взаимодействиях в основной жидкой фазе тестовой среды.

Так, в частности, по результатам наших предварительных исследований стальной Fe-электрод был чувствителен к ионам Al³⁺, Fe³⁺, Ni²⁺ и Cu²⁺, малочувствителен к ионам Ca²⁺ и Mg²⁺ и нечувствителен к ионам Н⁺, NH4⁺, Na⁺, K⁺ и Zn2⁺. Тогда как латунный СuZn-электрод был чувствителен к ионам NH4⁺, Na⁺, K⁺, Ca2⁺, Mg2⁺, Zn2⁺ и Cu2⁺ и малочувствителен к ионам Н⁺, Al3⁺, Fe3⁺ и Ni2⁺. При этом следует отметить, что, хотя в «классической» потенциометрии стремятся достичь наибольшей селективности измерительного электрода в отношении конкретных видов ионов, при биотестировании аналитика, в первую очередь, интересует изменение общего химического состава тестовой среды (вследствие осуществления там жизнедеятельности тестируемых бактерий), а не содержания в тестовой среде каких-либо конкретных видов ионов. Вследствие чего при биотестировании излишняя селективность сенсоров является фактором, негативно сказывающимся на адекватности результатов анализа.

Величины E_Fe и E_CuZn регистрировали с помощью специально изготовленных и принципиально новых двух потенциометрических датчиков, подобных комбинированному редокс-электроду «ЭРП-105», в котором платинированная проволока, входящая в состав индикаторного электрода, заменялась на проволоку, изготовленную из стали 30 (содержащей 98.75% Fe, 0.5% Mn, 0.2% Cr, 0.25% Si и 0.3% C) либо из латуни Л63 (содержащей 65% Cu и 38% Zn).

Электрохимический этап занимает не более 2 часов.

На следующем этапе обработки и интерпретации полученных данных степень биологической активности заданными концентрациями тестируемых эфирных масел рассчитывали по формулам, учитывающим средневзвешенные степени активирования либо ингибирования жизнедеятельности L.acidophilus и сводящим биологическую активность тестируемого образца к одной интегрированной переменной, учитывающей общую временнýю динамику изменения показаний трех разных потенциометрических датчиков, по разному оценивающих физико–химический состав тестовой среды.

Исследование показало, что с изменением концентраций эфирных масел достаточно существенно может меняться и характер их биологической активности. Среди исследованных масел наиболее активные антимикробные свойства проявили полученные из цветов гвоздичного дерева (Syzygium aromaticum), наименее активные антимикробные свойства — полученные из листьев эстрагона (Artemisia dracunculus). С уменьшением концентраций уменьшалась и антимикробная активность эфирных масел. Так, например, значения итогового показателя биологической активности эфирных масел из семян кардамона зеленого (Elettaria cardamomum) и побегов можжевельника обыкновенного (Juniperus communis) составили: –78 ± 11 и –62 ± 9%, –40 ± 6 и –27 ± 4%, –28 ± 5 и –19 ± 3% (концентрации соответственно 1 об.%, 0.5 об.%, 0.1 об.%.

Однако, биологическая активность эфирных масел существенно уменьшалась также с увеличением времени их взаимодействия с тестовыми микроорганизмами, что объясняется, вероятно, как адаптацией тестовых микроорганизмов к присутствию масел, так и уменьшением с течением времени активности и общего количества биологически активных веществ, содержащихся в исследуемых эфирных маслах, приходящихся на один тестовый микроорганизм. Таким образом, краткосрочная оценка биологической активности тестируемых объектов способствовала повышению не только оперативности анализа, но и его чувствительности, тогда как долгосрочные значения (2 часа) аналогичных величин в большей степени коррелировали с результатами анализа биологической активности тех же тестируемых объектов с помощью стандартной визуальной методики их микробиологического тестирования. Наконец, можно отметить, что все тестируемые в этой работе экстракты проявляли существенный антимикробный эффект при их концентрации в тестовой среде больше 1 об.%.

Разработанный дизайн исследования отличают новизна и прикладной характер, ценный для промышленного использования, в т.ч.:

1. оперативность, чувствительность и достоверность анализа (2 ч на один анализ, достоверность 95%),
2. информативность и объективность по сравнению с более распространенными визуальными методами оценки влияния различных химических соединений на динамику жизненной активности выбранных микроорганизмов,
3. экономичность и простота за счет возможности проведения анализа с использованием всего одного измерительного блока иономера.

С помощью разработанной методики можно провести сравнительный анализ биологической активности промышленно производимых углекислотных экстрактов в зависимости как от вида растительного сырья, из которого эти экстракты были получены, так и от их концентрации, а также от времени воздействия этих экстрактов на исследуемые микроорганизмы.

Присоединяйтесь к нам в соцсетях