Передовая методика микроскопии показывает крошечные структуры в мозге живой мыши

Исследователи адаптировали передовую методику микроскопии для получения 3D-изображений “сверхразрешения” внутри мозга живых мышей. Метод настолько точен, что команда ученых смогла изобразить крошечные веточки на ветвях нейронов и наблюдать, как они менялись в течение нескольких дней.

В ходе испытаний команда исследователей смогла сделать трехмерные снимки с очень высоким разрешением относительно глубоко в тканях животного — 76 микрометров в мозге живой мыши и 164 микрометра в образце ткани. Этот метод позволил получить изображение некоторых невероятно крошечных клеточных структур, называемых дендритными шипами. Если нейрон — это дерево, то дендриты — это ветви, которые тянутся к другим, а дендритные шипы — это ветви, выступающие из них.

“Наш микроскоп — это первый в мире инструмент, позволяющий достичь сверхразрешения глубоко внутри живого животного”, — говорит Йорг Беверсдорф, ведущий исследователь исследования. “Такие достижения в технологии визуализации глубоких тканей позволят исследователям непосредственно визуализировать субклеточные структуры и динамику в их родной тканевой среде.»

Новый метод основан на технологии под названием стимулированная эмиссионная обедненная микроскопия (STED), которая была разработана в 1990-х годах и принесла ученому Стефану Хеллу Нобелевскую премию по химии в 2014 году. Этот метод позволил оптическим микроскопам обойти физический предел размера в изображении, заставляя флуоресцировать наноразмерные объекты.

STED-микроскопия обычно проводится с молекулами, которые светятся при возбуждении лазером. Образец мишени окрашивается этими молекулами, затем над ними проносятся два лазера – первый возбуждает все молекулы, а второй заставляет более крупные молекулы разрядить свою энергию и перестать светиться. Конечным результатом является то, что флуоресцируют только мельчайшие молекулы, что позволяет получить изображение с чрезвычайно мелкими деталями. В последние годы ученым даже удалось адаптировать технику для получения трехмерных изображений.

Проблема в том, что 3D-визуализация STED до сих пор действительно работала только на тонких образцах. Это потому, что лазерный луч с трудом проходит через слишком много тканей, чтобы достичь молекул и возбудить их. Поэтому для нового исследования ученые преодолели это ограничение, объединив 3D-STED-визуализацию с другим методом, называемым двухфотонным возбуждением (2PE).

“2PE позволяет визуализировать более глубокие ткани, используя волны ближнего инфракрасного диапазона, а не видимого света”, — говорит Мэри Грейс Веласко, первый автор исследования. “Инфракрасный свет менее подвержен рассеянию и, следовательно, лучше способен проникать глубоко в ткани.”

Конечным результатом является технология, которую команда называет 3D-2PE-STED imaging (визуализация). Чтобы улучшить изображение еще больше, исследователи также использовали адаптивную оптику, которая исправляет аберрации или искажения формы света, которые могут быть получены при визуализации через ткань.

Технология превосходно показала себя в испытаниях. Первые эксперименты были проведены на культивируемых клетках, где 3D-2PE-STED визуализация позволила выявить детали в 10 раз меньшие, чем при использовании только 2PE.

В тестах на живых мышах исследователи смогли приблизить дендритные шипы, раскрыв их трехмерную структуру в мельчайших деталях. Они даже смогли показать естественные различия в структуре при визуализации той же области через три дня.

“Дендритные шипы настолько малы, что без сверхразрешения трудно визуализировать их точную 3D-форму, не говоря уже о каких-либо изменениях этой формы с течением времени, -говорит Мэри Веласко. — 3D-2PE-STED теперь предоставляет средства для наблюдения этих изменений и делает это не только в поверхностных слоях мозга, но и глубже внутри, где происходит больше интересных связей.”

Хотя ученые говорят, что они не видели никаких признаков повреждения, вызванного этой техникой, ни в структуре нейронов, ни в поведении мышей, они предполагают, что для обеспечения ее безопасности потребуются дальнейшие исследования.

Также можно использовать некоторую настройку, прежде чем новую технику можно будет использовать для изображения человеческих тканей – в этой версии флуоресцентные молекулы должны быть непосредственно “окрашены” на клетки-мишени, что может свести на нет в противном случае неинвазивный характер технологии. Будущие достижения, по словам команды, могут включать инъекционные красители.

Исследование было опубликовано в журнале Optica. 3D-изображение, полученное этим методом, можно увидеть на видео ниже.