Исследователи института Солка (Salk Institute) нанесли на карту геномы и эпигеномы генетически модифицированных линий растений с самым высоким разрешением, когда-либо существовавшим, чтобы точно определить, что происходит на молекулярном уровне, когда в них вставляется кусок чужеродной ДНК. Их результаты, опубликованные в журнале PLOS Genetics, разъясняют методы, используемые для модификации растений, и предлагают новые способы более эффективного сведения к минимуму потенциальных побочных эффектов.
«Это было действительно отправной точкой для того, чтобы показать, что можно использовать новейшие технологии картирования и секвенирования, чтобы оценить влияние вставки генов в геном растения», — говорит исследователь Медицинского института Говарда Хьюза Джозеф Экер (Joseph Ecker), профессор факультета молекулярной растительности Солка и заведующий лабораторией геномного анализа.
Когда ученые хотят внедрить новый ген в растение — для фундаментальных исследовательских целей или для улучшения здоровья продовольственной культуры — они обычно полагаются на Agrobacterium tumefaciens, чтобы выполнить свою работу.
Agrobacterium — это бактерии, вызывающие опухоли, большие выпуклости на стволах деревьев. Несколько десятилетий назад ученые обнаружили, что когда бактерии заражают дерево, они переносят часть своей ДНК в геном дерева. С тех пор исследователи использовали эту способность переноса Agrobacterium для своих собственных целей, используя его переносящую ДНК (Т-ДНК) для перемещения желаемого гена в растение.
Недавно технологии секвенирования ДНК начали намекать на то, что когда T-ДНК Agrobacterium используется для введения новых генов в растение, это может вызвать дополнительные изменения в структурных и химических свойствах нативной ДНК.
«Биотехнологические компании тратят много времени и усилий на то, чтобы охарактеризовать трансгенные растения и игнорировать кандидатов с нежелательными изменениями, не понимая — с базовой биологической точки зрения — почему эти изменения могли произойти», — говорит Экер. «Наш новый подход предлагает способ лучше понять эти эффекты и может помочь ускорить процесс».
Поскольку подход Т-ДНК может привести к интеграции множества копий гена в растение, может быть трудно изучить конечный результат при стандартном секвенировании ДНК, так как большинство технологий борются за последовательность повторяющихся участков ДНК. Но исследователи обратились к новой комбинации подходов, включая оптическое картирование и секвенирование нанопор, чтобы посмотреть на эти длинные отрезки в высоком разрешении.
Они применили технологии к четырем случайно выбранным линиям Т-ДНК Arabidopsis thaliana, широко используемого в биологии модельного растения. (Эти растения получены из большой популяции инсерционных мутантов T-ДНК, которые были созданы с использованием метода трансформации Arabidopsis, называемого цветочным падением, для изучения функции генов.)
Оптическое картирование показало, что у растений было от одного до семи различных вставок или перестроек в их геномах, размер которых колебался до десяти раз. Секвенирование нанопор и реконструкция геномов двух линий подтвердили вставки с разрешением по одной букве, включая целые сегменты ДНК, которые были обменены или перемещены между хромосомами в одной из выбранных линий. Сами вставки генов демонстрировали множество паттернов, причем вставленный фрагмент ДНК иногда скремблирован, инвертирован или даже заглушен.
«Это исследование было невозможно даже год назад», — говорят ученые. «Секвенирование нанопор, которое некоторые называют «святым Граалем» секвенирования ДНК, революционизировало чтение даже самых сложных областей генома, которые до сих пор были полностью недоступны и неизвестны».
Наконец, когда исследователи изучали пакеты генетического материала, называемого гистонами, они обнаружили дополнительные изменения. Гистоновые белки упаковывают ДНК в структурные единицы, и модификации этих гистонов обеспечивают возможность доступа к гену для использования клеткой (уровень регуляции, называемый эпигенетикой). В зависимости от того, где Т-ДНК была интегрирована, некоторые близлежащие модификации гистонов появлялись или исчезали, потенциально изменяя регуляцию или активацию других соседних генов.
«Теперь у нас есть первое понимание высокого разрешения о том, как вставки Т-ДНК могут формировать локальную среду эпигенома», — говорят исследователи. В будущем T-ДНК будет вставлять одну функциональную копию нужного гена без побочных побочных эффектов на геном растения.
Florian Jupe et al, The complex architecture and epigenomic impact of plant T-DNA insertions, PLOS Genetics (2019). DOI: 10.1371/journal.pgen.1007819