Ученые сочетают CRISPR и штрих-код ДНК для отслеживания роста рака

Ученые Стэнфорда нашли способ модифицировать пары генов, связанных с раком, в легких мышей, а затем точно отслеживать отдельные клетки полученной опухоли — это комбинированный метод, который может значительно ускорить исследования рака и развитие лекарств.

Работа может наконец позволить ученым изучить генетическое разнообразие клеток, обнаруженных в опухолях вне лаборатории.

«Рак человека не имеет только одной мутации — у них есть комбинации. Вопрос в том, как разные мутированные гены сотрудничают или не сотрудничают друг с другом?» — сказал Монте Уинслоу, генетик из Медицинской школы Стэнфорда и старший автор исследования, опубликованный 2 апреля в журнале Nature Genetics.

Всего несколько лет назад такое исследование было бы монументальным, многолетним усилием. Это потребовало бы размножения нескольких линий генетически модифицированных мышей, каждая из которых имела бы другую пару инактивированных генов-супрессоров опухолей. Чтобы исследовать все возможные комбинации, понадобились сотни или тысячи мышей.

Напротив, Уинслоу и его коллеги провели свои эксперименты в течение нескольких месяцев с участием менее двух десятков мышей. «Мы проанализировали больше генотипов опухолей рака легкого, чем вся область в течение 15 лет», — сказал Уинслоу.

Неожиданная идея

Команда ученых достигла этого результата, используя CRISPR-Cas9 — мощный инструмент для редактирования генов, который может легко заменять, модифицировать или удалять генетические последовательности внутри организмов — создавать множественные генетически отличные опухоли в легких отдельных животных. «Мы можем индуцировать тысячи клональных опухолей у одной мыши», — сказал Уинслоу.

Однако для того, чтобы сделать полезные выводы о комбинаторных эффектах различных мутаций генов, ученым необходим точный способ маркировки и отслеживания роста различных опухолей. И здесь обычные методы, связанные с попытками вырезать и сравнивать размеры отдельных опухолей, были недостаточными.

«Мало того, что это было очень медленно, но как вы вырежете опухоль, которая имеет странную форму, или ту, которая прилипает к другой опухоли?» сказал соавтор исследования Ян Уинтерс, аспирант в лаборатории Уинслоу. «Нам нужен был лучший способ количественно определить размеры опухоли».

Решение исходило из неожиданного источника. Дмитрий Петров, эволюционный биолог в Стэнфорде, который является старшим автором нового исследования, работал со Стэнфордским физиком Даниэлем Фишером и генетиком Гэвином Шерлоком, чтобы разработать штриховое кодирование ДНК как способ исследования быстрой эволюции дрожжей. Когда Петров узнал об экспериментах в группе Уинслоу, он подумал, что эта техника может также работать и на мышах.

«Дмитрия такой парень, у которого много идей, и сначала мы не думали, что то, что он предлагал, было возможно», — сказал Уинслоу. «Но после того, как мы подумали об этом пару дней, мы поняли, что, на самом деле, может быть, мы сможем это сделать».

Подсчет штрих-кодов

Идея Дмитрия Петрова заключалась в том, чтобы присоединить короткие, уникальные последовательности ДНК к отдельным опухолевым клеткам внутри легких мышей. Каждая последовательность функционирует как наследственный генетический штрих-код, и по мере того как каждая клетка делится, растет опухоль, число штрих-кодов также умножается.

Теперь, вместо того, чтобы кропотливо вырезать отдельные опухоли, ученые могли взять все раковое легкое, разделить его, а затем использовать высокопроизводительное секвенирование ДНК и вычислительный анализ, чтобы очень точно определить, насколько велика опухоль, посчитав, как часто появляются штрих-коды. Подбирая разные штрих-коды, ученые могут сравнивать размеры опухолей намного быстрее, чем это было возможно ранее.

«Это 10 шагов вперед в нашей способности моделировать рак человека», — сказал Дмитрий Петров. «Теперь мы можем генерировать очень большое количество опухолей с определенными генетическими сигнатурами в одной и той же мыши и последовательно следить за их ростом в масштабе и с высокой точностью. Предыдущие методы были на порядок медленнее и гораздо менее качественными».

Генетическое разнообразие

Комбинация CRISPR-Cas9 и штрихового кодирования ДНК может позволить ученым повторить в лаборатории вид генетического разнообразия, наблюдаемый у больных раком. «Это обостряет страх перед сложностью рака, — сказал Уинтерс. «Мы знаем на протяжении десятилетий, что человеческие опухоли чрезвычайно сложны и отличаются от пациента к пациенту. Сейчас мы можем смоделировать 30 различных генетических вариаций рака одновременно.»

Одним из ярких результатов исследования команды является то, что многие гены-супрессоры опухолей зависят от контекста, то есть они влияют только на рост рака в присутствии или отсутствии другого гена. «Мы теперь в хорошем положении, чтобы понять, как ключевые факторы рака взаимодействуют друг с другом, и почему опухоли с одинаковыми мутациями иногда растут, чтобы быть очень большими, а иногда и нет», — сказал первый соавтор исследования Кристофер Макфарланд, аспирант в Лаборатории Петрова.

Гибридная методика команды ученых также может оказаться полезной при тестировании на наркотики. Фармацевтические компании могли одновременно тестировать лекарство по тысячам вариантов опухоли, чтобы увидеть, какие из них реагируют на лечение, и, что не менее важно, а какие нет.

«Мы можем помочь понять, почему целенаправленная терапия и иммунотерапия иногда очень хорошо работают у пациентов, а иногда терпят неудачу», — сказал Петров. «Мы выдвигаем гипотезу, что генетическая идентичность опухолей может быть частично ответственна за это, и у нас наконец есть хороший способ проверить гипотезу».

Больше информации: Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice, Nature Genetics (2018). nature.com/articles/doi:10.1038/s41588-018-0083-2